Utilização de um revestimento comestível para o controlo de Salmonella enterica e Norovírus murino em morango congelado

Uma década após a publicação do relatório da EFSA (2014), que apontava o risco associado à presença de Salmonella spp. e Norovírus em frutos vermelhos, a sua presença nestes frutos continua a ser reportada. O objetivo deste trabalho foi desenvolver o revestimento comestível RP-7 capaz de reduzir a população de Salmonella enterica e Norovírus murino em morangos congelados. A sua aplicação reduziu a população de S. enterica em mais de 2,5 logaritmos na primeira semana de congelação e atingiu contagens abaixo do limite de deteção (1 log ufc/morango) na oitava semana. Relativamente ao Norovírus, a sua população foi reduzida em quase dois logaritmos na oitava semana. Portanto, a aplicação de RP-7 é uma alternativa eficaz para reduzir a população de S. enterica e Norovírus em morangos congelados.

O morango é uma fruta muito apreciada pelos consumidores que contém compostos fenólicos relacionados com a inibição da proliferação de células cancerígenas e a melhoria da saúde cardiovascular (Mortas & Sanlier, 2017). Estes benefícios associados ao seu consumo podem ser algumas das razões pelas quais a sua produção aumentou [em Espanha] 10,15% nos últimos anos, atingindo 346.484 t e ocupando 7.328 ha de cultivo, sendo Espanha um dos principais países produtores da União Europeia (MAPA, 2023).

No entanto, os morangos são muito suscetíveis a alterações microbianas, pelo que têm um prazo de validade muito curto. A congelação deste tipo de fruta tornou possível o consumo de morangos no seu estado ótimo de maturação, fora de época e longe da zona de produção. Para tal, pode aplicar-se a criocongelação, na qual o alimento entra em contacto com azoto líquido ou dióxido de carbono, produzindo uma descida muito rápida da temperatura. Desta forma obtêm-se alimentos com uma textura muito semelhante à original e que conservam as mesmas caraterísticas organoléticas e nutricionais dos produtos frescos.

Em 2014 a Agência Europeia para a Segurança Alimentar (EFSA, 2014) publicou um relatório que salientava o risco associado à presença de Salmonella spp. e Norovírus em frutos vermelhos, incluindo morangos. Entre algumas das recomendações finais, indicava a necessidade de amostragens específicas para Norovírus em diferentes tipos de frutos vermelhos, na produção primária, após processamento mínimo (incluindo congelação) e no ponto de venda. As fontes de contaminação das bagas por Salmonella e Norovirus são muito semelhantes. Embora pouco documentada é influenciada por aspetos ambientais (proximidade de explorações pecuárias e condições climáticas), pela utilização de estrume ou adubo não tratados, pela utilização de água agrícola contaminada e pela contaminação cruzada por manipuladores e equipamentos de colheita.

Para prevenir a Salmonella e o norovírus na produção e no processamento, é importante que os produtores apliquem corretamente as Boas Práticas Agrícolas (BPA), as Boas Práticas de Higiene (BPH) e as Boas Práticas de Fabrico (BPF). Embora Ortiz-Solà et al. (2020) não tenha detectado a presença destes agentes patogénicos em morangos produzidos em Espanha, desde 2020 houve 14 alertas alimentares a nível europeu para a presença de vírus (Norovírus e Hepatite A) ou Salmonella spp. em frutos de baga (RASFF, 2024). Estes alertas mostram que as recomendações da EFSA não foram suficientes para garantir a segurança microbiológica destes alimentos. Por conseguinte é necessário aplicar uma nova barreira que complemente as anteriores e permita à indústria alimentar reduzir a população destes agentes patogénicos em frutos congelados, caso possam estar presentes e, ao mesmo tempo, ser aceites pelo consumidor. A utilização de substâncias antimicrobianas, como os óleos essenciais, pode controlar o crescimento de microrganismos patogénicos (Scientific Committees, 2024) durante o tempo de vida útil do produto.

O objetivo deste trabalho foi desenvolver um protótipo de revestimento comestível (RP-7), formulado a partir de uma pectina obtida de subprodutos da indústria alimentar e de óleos essenciais, com capacidade antimicrobiana para minimizar o risco microbiológico associado à Salmonella enterica e ao Norovírus murino em morangos congelados.

1. Preparação do material vegetal e revestimento

Foram utilizados morangos (Fregaria x ananassa) obtidos em distribuidores locais e armazenados a 4°C até à realização dos testes. Os principais ingredientes do revestimento RP-7 são uma pectina revalorizada (Cargill; E-440) e dois óleos essenciais (carvacrol e citral). O revestimento foi preparado no laboratório no dia anterior à aplicação.

2. Produção de microrganismos

O efeito antimicrobiano do revestimento RP-7 foi estudado contra um cocktail de três estirpes de S. enterica [Montevideo (ATCC BAA-710), Gaminara (ATCC BAA-711) e Enteritidis (CECT 4300)] e contra o Norovírus murino (MNV-1).

3. Experimentação em morangos

Os morangos foram inoculados com o cocktail de S. enterica ou com o caldo de Norovirus murino para obter uma concentração de 106 ufc/morango. Após a inoculação, os morangos foram mantidos no frigorífico até ao dia seguinte.

No dia do teste, os morangos foram revestidos por imersão num banho de RP-7. Em seguida, foram deixados a secar durante 45 minutos a 4°C. Os morangos de controlo não foram revestidos, mas foram deixados em refrigeração durante o mesmo tempo. Após o tempo de secagem os morangos foram congelados por contacto com azoto líquido durante 30 minutos e armazenados a -20°C durante oito semanas.

Para determinar a concentração de S. enterica nos morangos, os frutos diretamente congelados foram colocados individualmente num saco estéril com água de peptona tamponada (APT; Biokar, Beauvis, França) e esfregados durante 90 segundos. Seguiu-se uma série de diluições decimais em solução peptonada salina (PS; 8,5 g/L NaCl e 1 g/L peptona) e semeadas em meio de ágar XLD, seletivo para a contagem de S. enterica (XLD; Biokar, Beauvis, França).

Para o Norovírus as contagens foram efetuadas de forma homóloga utilizando TGBE (12,1 g/L de base Tris, 3,8 g/L de glicina e 10,0 g de extrato de carne) como diluente. O diluente foi então centrifugado e o sobrenadante foi titulado utilizando células RAW 264.7.

4. Aceitação visual

Para avaliar o efeito da aplicação do revestimento RP-7 no aspeto dos morangos congelados, foi efetuado um teste em instalações piloto utilizando uma câmara de congelação criogénica arrefecida por injeção de azoto líquido (N2) no seu interior (Carburos Metálicos-Air Products Group modelo Batch Freezer CM-85/1090). Para este efeito os morangos foram lavados e metade deles foram revestidos com RP-7. Após a secagem do RP-7, o fruto foi crio-congelado e armazenado durante um mês a -20 °C. Após este período, os morangos foram descongelados e o seu aspeto visual foi avaliado por 50 juízes não treinados, utilizando uma escala hedónica de 9 pontos (1 significa “não gosto muito” e 9 significa “gosto muito”). O aspeto dos morangos foi comparado com morangos comerciais congelados que foram descongelados de forma semelhante aos congelados numa fábrica-piloto.

5. Processamento de dados e análise estatística

Os resultados microbiológicos foram transformados em logaritmo decimal (log ufc/morango). Quando as bactérias não puderam ser contadas, mas foram detetadas após enriquecimento, os resultados foram expressos como presença abaixo do limite de deteção (1 ufc/mL). Quando o agente patogénico não pôde ser contado e, após enriquecimento, também não foi detetado, os resultados foram expressos como não deteção. Todos os resultados foram analisados utilizando o programa estatístico JMP Pro-17 (SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA). Os dados obtidos foram tratados por um teste de análise de variância (ANOVA) para calcular as diferenças significativas entre os resultados. Para observar essas diferenças foi aplicado o teste de Tukey Honest Significant Difference (HSD) para médias. O critério de nível de significância foi p<0,05. O teste t-student também foi utilizado com o nível de significância de p<0,05.

1. Eficácia da aplicação de RP-7 contra S. enterica em morangos congelados

A concentração de S. enterica inoculada em morangos não revestidos foi de 5,9 ± 0,4 log ufc/morango (Figura 1). No tempo 0 (imediatamente após a congelação) a população de S. enterica nos morangos RP-7 era 2 unidades logarítmicas inferior à do controlo. Ao longo da conservação em congelação a população da bactéria permaneceu constante nos morangos não revestidos, enquanto nos morangos RP-7 a população de S. enterica diminuiu significativamente com reduções de mais de duas unidades logarítmicas em comparação com o controlo, atingindo uma população abaixo do LD após oito semanas a -20°C.

Figura 1. População de S. enterica inoculada artificialmente em morangos não revestidos (Controlo) e revestidos (RP-7) armazenados a -20°C. As letras indicam diferenças significativas entre os tempos para cada tratamento de acordo com o teste HSD de Tukey (p < 0,05). Os asteriscos (*) indicam diferenças significativas entre os dois tratamentos num determinado momento, de acordo com o teste t-student (p < 0,05).

Vários autores descreveram o efeito antimicrobiano dos óleos essenciais. Por exemplo, Cabarkapa et al. (2019) observaram como o carvacrol reduziu a capacidade de formação de biofilme de três cepas de S. Typhimurium. Noutro estudo a aplicação de óleos essenciais encapsulados em combinação com ultrassons em tomates “cherry” frescos reduziu significativamente a população de Salmonella (Su et al., 2023). Por outro lado, a combinação de antimicrobianos demonstrou ter um efeito sinérgico (Shi et al., 2016). A atividade antimicrobiana dos óleos essenciais está associada à sua estrutura química que pode alterar a permeabilidade da membrana celular e levar à morte celular.

2. Eficácia da aplicação do RP-7 contra o Norovírus murino em morangos congelados

No caso do Norovírus murino a aplicação de RP-7 reduziu a sua população a partir da primeira semana de congelação, quando se observaram diferenças significativas entre a população nos morangos de controlo e nos morangos com RP-7 (Figura 2). Além disso, a população dos morangos de controlo manteve-se acima da população dos morangos com RP-7 durante as oito semanas de congelação, com populações superiores a 5 logaritmos upf/morango. Em contraste, foi observada uma diminuição da população de 2,1 unidades logarítmicas nos morangos RP-7 entre o tempo 0 e a semana 8.

Figura 2. População de Norovírus murino inoculado artificialmente em morangos não revestidos (Controlo) e revestidos (RP-7) armazenados a -20°C. As letras indicam diferenças significativas entre os tempos para cada tratamento de acordo com o teste HSD de Tukey (p < 0,05). Os asteriscos (*) indicam a existência de diferenças significativas entre os dois tratamentos num determinado momento, de acordo com o teste t-student (p < 0,05).

Os mecanismos de ação dos óleos essenciais para inativar o Norovírus são variados. Por exemplo, Gilling et al. (2014) observaram que o citral não degradou o capsídeo do vírus, mas aumentou de tamanho por uma ligação entre a substância e o capsídeo. Esta ligação poderia afetar a infecciosidade do vírus. Outros autores observaram como a aplicação de um revestimento à base de chá verde reduziu a população de norovírus murino em mais de duas unidades logarítmicas após 24 h a 10°C (Falcó et al., 2019). No nosso caso, após oito semanas, obtivemos uma redução de mais de duas unidades logarítmicas. O tempo mais longo necessário para obter a mesma redução pode dever-se ao facto de os morangos terem sido mantidos congelados, uma temperatura à qual o vírus permanece dormente e está protegido da ação dos óleos essenciais.

3. Aceitação visual

Não foram observadas diferenças significativas entre a aceitabilidade visual dos morangos de controlo e dos morangos revestidos com RP-7 após a descongelação (figura 3). No entanto, os morangos comerciais obtiveram uma classificação significativamente inferior. Visualmente os morangos comerciais obtiveram 3,9 ± 1,8 pontos. Em contrapartida, o controlo e o RP-7 excederam ambos os sete pontos. Por conseguinte, a aplicação da RP-7 não afetou significativamente a aceitabilidade visual para o consumidor. Em contrapartida, a criocongelação da fábrica-piloto teve um efeito positivo no aspeto dos morangos após a descongelação.

Figura 3. Aceitabilidade visual de morangos descongelados não revestidos (Controlo), revestidos (RP-7) e comerciais (CO) após um mês de armazenamento a -20°C. As letras indicam diferenças significativas entre os tempos para cada tratamento de acordo com o teste HSD de Tukey (p < 0,05).

Os resultados deste estudo demonstram a atividade antimicrobiana do revestimento comestível RP-7. No caso da S. enterica a aplicação do RP-7 reduziu significativamente a população do agente patogénico no início do tempo em comparação com o controlo. No caso do Norovírus, a aplicação do RP-7 reduziu a população em mais de duas unidades logarítmicas em comparação com o controlo. Além disso, a aplicação de RP-7 não afetou a aceitabilidade visual dos morangos após a descongelação. Portanto, a aplicação do protótipo RP-7 pode ser uma alternativa eficaz para melhorar a segurança alimentar e a qualidade dos morangos congelados.

Agradecimentos

Atividade financiada através da operação 01.02.01 de Transferência Tecnológica do Programa de Desenvolvimento Rural da Catalunha (2014-2022). Os autores gostariam também de agradecer à Carburos Metálicos-Grupo Air Products pela sua colaboração no financiamento.

BIBLIOGRAFIA

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